一文读懂Crystal Digital PCR™与定量PCR的测量精准度对比

本文亮点预告

☆ 数字PCR为终点法检测，直接进行核酸绝对定量，每个样品可产生大量微滴。Crystal Digital PCR的测量变异性比qPCR低2倍。

☆ 使用Crystal Miner软件的pooling功能对两个孔进行合并分析时，对于Crystal Digital PCR来说，测量变异性较qPCR降低至几乎3倍。

☆ Crystal Digital PCR提供了各种应用所需的高精准度，包括拷贝数变异，低浓度差异和稀有突变检测。

实时定量PCR（Real-Time PCR quantification，qPCR）是将未知样品的Cq值与含有已知核酸浓度的标准品的Cq值进行比较。与qPCR相反，数字PCR（dPCR）无需参考标准品即可对核酸进行绝对定量。数字PCR具有比qPCR更高的精确度和重复性。在这里，我们比较了使用Naica™系统的Crystal Digital PCR™（cdPCR）技术和qPCR技术的精度和可重复性。在这项研究中，我们做出了最大的努力来减少实验的可变性，以便仅评估该技术固有的可变性。我们对比了23组qPCR和cdPCR样本的定量变异性，这些样本来自于同一管PCR Mix，并包含终浓度为175 cp/μL的人类基因组DNA。使用两种技术对靶基因ALB进行量化，两个平台均为相同的实验人员操作以及相同的25μL终体积 (见实验设置，图1)。

一般来说，qPCR标准曲线是由不同的商品化DNA或标准品产生的。扩增效率并不是针对每个样本系统地确定的，而是基于一个定性的内部阳性对照。因此，不能完全评估抑制或非特异性扩增的存在。在这项研究中，我们同时使用相同的DNA样品进行标准曲线制备和样品定量。标准曲线要求R²≥0.990，本次实验在定量范围内获得了98. 1％（R² = 0.991）的高扩增效率，（图2A、2B）。

cdPCR可以直接进行绝对定量，因此无需利用标准曲线。此外，cdPCR对DNA提取物中天然存在的PCR抑制物耐受度更高（有关更多信息，请参见关于抑制剂对数字PCR的影响的应用说明，网址为：https://www.stillatechnologies.com/effect-of-inhibitors-crystal -dpcr-vs-qpcr /）。实际上，在cdPCR中，只要可以通过Crystal Miner软件自动划分或通过实验人员手动划分可清晰区分阴阳性微滴的阈值线，就可以直接定量。

精准度性能比较

从相同的PCR预混液中，共得到46个技术重复样品，并将其分成2组（23个样品一组），然后使用qPCR和cdPCR进行测量和比较（图3A）。在cdPCR中分析的23个样品总共产生了604,867个微滴，因此每个样品平均产生26,299个微滴。针对每组值通过贝塞尔校正得到的变异系数（％CV）（图3B）。各自的CV值表明cdPCR的测量变异性（％CV = 2.3）比qPCR的测量变异性（％CV = 5.0）小2倍以上。

更重要的是，cdPCR允许将重复样品合并作为一个较大的样品进行分析。我们比较了以2个样本为一组的cdPCR与qPCR中11个独立重复样本的平均值。合并cdPCR样品时，cdPCR（％CV = 1.5）的测量变异性几乎比qPCR样品（％CV = 4.4）的测量变异性低3倍（65.9％）（图4A和4B）。实际上，合并的孔数越高，总的分析体积和被分析的微滴总数就越高，从而降低了采样误差和分配误差，并降低了定量的不确定性。

想了解更多关于Naica数字PCR的应用，可点击下方链接：

● 应用文献：两种多重数字PCR试剂检测EGFR的活化和耐药位点

● 文献分享 | 基于Naica 数字PCR平台三色检测Her2基因拷贝数变异

● 教你如何同时鉴别和定量耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

● 应用文献 | 用数字PCR方法单次实验同时检测ECFR活化突变位点和耐药突变位点