使用 3D 生物打印宫颈癌肿瘤模型进行体外自然杀伤细胞检测

▌摘要

自然杀伤 (NK) 细胞是一种先天免疫细胞，通过发挥细胞毒性作用，在清除体内转化或癌细胞方面发挥着关键作用。近年来，已经测试了几种免疫刺激分子和生物制剂来改善NK细胞的肿瘤溶解作用。三维 (3D) 细胞培养技术已经发展到更好地概括体内结构和生理相关性，以在体外评估此类药物和生物制剂。在这项概念验证研究中，我们开发了一种3D生物打印宫颈癌肿瘤模型，以证明离体NK细胞的细胞毒活性。绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的人宫颈癌细胞SiHa和CaSki用胶原蛋白 I 进行3D生物打印，并与人外周血来源的NK细胞共培养96小时。通过荧光成像评估了NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用，结果表明，随着NK细胞浓度的增加，肿瘤杀伤程度更高。本文描述的方法是可扩展的，与高内涵成像兼容，并且易于转化为其他肿瘤模型。

▌材料和方法

细胞和细胞系制备人宫颈癌细胞系SiHa (ATCC HTB-35) 和CaSki (ATCC CRL-1550) 获自ATCC。SiHa和CaSki细胞分别在补充有10%热灭活FBS、1% Pen/Strep溶液的EMEM和RPMI-1640 培养基中培养。如前所述（Kercher，2020），用编码GFP的慢病毒转导SiHa和CaSki细胞。转导后72小时，使用FACSaria (BD Biosciences) 细胞分选仪对稳定的GFP表达细胞进行分选。从健康供体的外周血中收集原代人 NK 细胞 (2W-501, Lonza)，进行阴性选择，然后冷冻保存。在存在500 U/mL人重组IL-2 (PeproTech, 200-02) 的情况下，将NK细胞解冻并在LGM-3淋巴细胞生长培养基 (Lonza, CC-3211) 中培养。将所有细胞在5%CO2的加湿培养箱中保持在37°C。

▲ 图 1. 3D 生物打印 NK 细胞毒性测定。(A) NK 细胞介导的细胞毒性机制：NK 细胞在肿瘤细胞表面寻找“缺失”受体，例如 MHC I 类分子。NK 细胞的溶细胞活性受从细胞表面受体接收的信号的相对平衡调节，这些受体传递激活或抑制信号。(B) 宫颈肿瘤的 3D 生物打印。使用胶原蛋白和 BIO X 的液滴打印功能对 SiHa 和 CaSki 细胞进行生物打印。在引入与 NK 细胞的共培养之前，将胶原液滴（肿瘤模型）热凝胶化并在生长培养基中保持 4 天。

生物墨水制备和生物打印

根据制造商的说明，将胶原蛋白 I（Coll-1，CELLINK）中和并与每毫升胶原蛋白 1 x 106 SiHa 或 CaSki 细胞混合。所有组件，包括注射器、针头等，都保存在冰上，直到准备好使用。温控打印头 (TCPH) 设置为 8°C，打印床设置为 10°C。三维 (3D) SiHa 或 CaSki 肿瘤通过在 96 孔板 (n=3) 中使用 BIO X（软件版本 1.8）上的液滴功能分配约 8 μL 的细胞胶原悬浮液进行生物打印（参见图 1B）。1 mL 细胞胶原悬浮液的总体积足以在 96 孔板中打印肿瘤液滴。打印后，将 96 孔板转移到 37°C 加湿培养箱中 20 分钟以允许胶原蛋白聚合。接下来，将 200 μL EMEM (SiHa) 或 RPMI-1640 (CaSki) 培养基添加到每个孔中。每 2 天更新一次培养基。生物打印的构建体在第 5 天与 NK 细胞共培养之前生长了 4 天。在第 4 天，使用 Alexa 面粉 647 缀合的鬼笔环肽对一些样品进行肌动蛋白染色。

3D 共培养

测定在第 5 天，在 IL-2 存在的情况下，在 200 µL LGM-3 生长培养基中清洗打印的肿瘤并与 NK 细胞以不同的效应物与靶标 (E:T) 比率（0 到 20）共培养 72 小时 . 对于阳性对照，将肿瘤与依托泊苷或 TNFα 一起孵育以通过凋亡诱导细胞死亡。阴性对照孔未接受任何 NK 细胞或凋亡诱导剂。

成像和统计

在实验结束时，打印的肿瘤在成像前用碘化丙啶 (PI) 染色 10 分钟。PI 用 DPBS 洗涤两次以去除松散粘附/死亡的 NK 细胞。如前所述（Kercher，2020），GFP 荧光的丧失和 PI 信号的升高被用作肿瘤细胞死亡的读数。使用荧光显微镜进行成像。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量荧光强度，并使用GraphPad Prism 8制备图形。结果在Prism中采用Student 's t检验进行统计学测量，数据用均数±SEM表示。

▲ 图 2. 用慢病毒转导人宫颈癌细胞 SiHa 和 CaSki 以表达 GFP。(A- - D) SiHa 和 CaSki 细胞在 2D 单层中生长并使用明场 (BF) 和 GFP 通道成像。(E- - F) 表达 GFP 的细胞与胶原蛋白 I 混合，并在 96 孔板中进行 3D 生物打印。在第 4 天捕获了 3D 构建体的图像。(G--H) 在第 4 天，使用 Alexa Flour 647 缀合的鬼笔环肽对肿瘤样品进行肌动蛋白染色。比例尺 = 100 µm。

▌结果和讨论

肿瘤细胞生长和生物打印肿瘤形成

BIO X 上的液滴功能能够在 96 孔板中自动分配一致的胶原肿瘤液滴。液滴形状和孔位置的均匀性有助于整个显微镜和分析工作流程。对 3D 生物打印的肿瘤液滴进行 GFP 荧光成像并用 PI 染色以确定细胞活力。图 2 中所示的结果表明，在第 4 天，宫颈癌细胞在打印的肿瘤中是存活的。鬼笔环肽染色（图 2G--H H）显示了 3D 生物打印肿瘤内细胞周围的特征性肌动蛋白积累。

▲ 图 3. 3D 中的 NK 细胞毒性测定。(A) CaSki 细胞被 3D 生物打印并与 NK 细胞共培养。明场图像显示在打印的肿瘤外围浸润 NK 细胞。(B) 在共培养结束时，生物打印的肿瘤被 PI 染色，并使用 GFP 和 PI 通道捕获图像并使用 ImageJ 合并。(C) 一系列 E:T 比率 (0 到 20) 用于共培养。SiHa（上）和 CaSki（下）细胞的生物打印肿瘤模型均显示出肿瘤细胞活力的 NK 细胞剂量依赖性降低。比例尺 = 100 µm。

肿瘤-NK共培养和细胞毒性分析

NK 细胞介导的细胞毒性进行了定量和定性验证。共培养的明场图像表明 SiHa 和 CaSki 细胞类型的肿瘤-NK 细胞相互作用（图 3A）。光成像和定量后，观察到NK细胞浓度依赖性降低肿瘤细胞活力。在20:1 (E:T)的比例下，与没有NK细胞的对照组相比，观察到有统计学意义(p=0.0003)的肿瘤生存能力下降(~ 60%-70%)。在存在或不存在 NK 细胞的情况下，打印的肿瘤 SiHa 和 CaSki 的代表性图像如图 3 所示，当 NK 细胞存在于共培养物中时，GFP 荧光会出现质量下降。最有趣的是，打印肿瘤的外周在 NK 细胞存在下显示出 GFP 荧光的最大减少（图 4），表明 NK 细胞浸润到打印肿瘤的胶原基质中。然而，NK 细胞的特异性染色对于确认 NK 细胞浸润的程度是必要的。

▲ 图 4. 肿瘤细胞杀伤模式。在没有 NK 细胞的情况下，SiHa 肿瘤表达明亮的 GFP 荧光（左图）。然而，当与 NK 细胞共培养时，整体 GFP 荧光强度降低，这在打印肿瘤的外同心环中显著降低（由白色箭头指示的白色虚线）（右图）。比例尺 = 500 µm。

▌结论和未来方向

▶  液滴 3D 生物打印技术可用作自动化过程，用人类宫颈癌细胞 SiHa 和 CaSki 可重复地制造肿瘤，这代表了一种多功能的体内样模型，以促进免疫肿瘤学研究。

▶  在与人类 NK 细胞共培养研究期间，3D 生物打印的肿瘤细胞在胶原基质中保持受限和存活。

▶  在细胞毒性试验中，人外周血来源的 NK 细胞在癌细胞杀伤中表现出细胞浓度（E:T 比）依赖性增加。

▶  NK细胞细胞毒性测定与高内涵成像工作流程兼容，也可适用于包括PDX类器官在内的其他肿瘤模型，以加速药物筛选过程并推动个性化药物的临床转化。

▶  此外，BIO X 上的多壁生物打印格式可用于扩大对生物制剂（如免疫检查点抑制剂）和工程 NK 细胞（CAR-NK）的高通量筛选的支持。进一步的研究可能包括量化 NK 细胞浸润到肿瘤和肿瘤或 T 细胞释放的细胞因子。